Revista Médica del Nordeste -  N° 5 -  Marzo de 2004

 

 

 

ESTIMULACIÓN SIMULTANEA DE LA GRANULOPOYESIS Y ERITROPOYESIS EN RATONES PRETRATADOS CON CICLOFOSFAMIDA

 

 

Barrios Lilian, Poletti Oscar H. Cátedra Nº 1 de Fisiología Humana. Departamento de Ciencias Básicas. Facultad de Medicina de la UNNE. Moreno 1240  -  CP:3400 Corrientes.  

 

 

ANTECEDENTES 

La disponibilidad para uso terapéutico de factores de crecimiento hematopoyéticos recombinantes en el comercio de nuestro país, ha significado un importante estímulo,  tanto para realizar estudios  con el objeto de dilucidar los mecanismos de la hematopoyesis  alterados en pacientes con patologías que afectan al proceso de formación de las células sanguíneas,   como para investigar el efecto farmacológico de  la aplicación de los factores de crecimiento hematopoyético.

Dentro de esta problemática, un área que genera interrogantes, es el comportamiento de progenitores comunes a varias células sanguíneas, cuando dicha célula está siendo estimulada para aumentar dos tipos celulares diferentes mediante la administración de dosis farmacológicas de los correspondientes factores de crecimiento recombinantes . 

La administración de eritropoyetina  recombinante ha demostrado producir recuperación de la anemia que acompaña  al tratamiento con quimioterapia antineoplásica en pacientes oncológicos (1). 

 Por otro lado   el  factor estimulante de colonias de granulocitos  recombinante humano   (G-CSF) ha reducido la morbilidad relacionada  a la infección  en pacientes con cáncer, aliviando la neutropenia  postquimioterapìa.(2).

Sin embargo, distintos estudios encuentran resultados dispares al administrar conjuntamente los dos factores de crecimiento, que actúan sobre una célula precursora común: la unidad formadora de colonias de granulocitos, eritrocitos, megacariocitos y macrófagos  (GEMM-CFU). 

Como ejemplo podemos mencionar que, en un estudio clínico realizado por Negrin (3) y col en el año 1996, en 44 pacientes con diferentes subtipos de síndrome mielodisplástico   (pacientes con severas citopenias refractarias) tratados simultáneamente con G-CSF y Epo, estos autores hallaron que  21 pacientes (48 %)  presentaron  además de la respuesta de aumento de neutrófilos esperada, una mejor respuesta del compartimento eritroide.  El resultado obtenido fue muy superior  al 10 a 28 % de pacientes que ellos hallaron que respondían   con respuesta eritroide adecuada a la administración de Epo sola.

Sin embargo, Musto y col (4) , en  un estudio realizado en 12 pacientes con síndrome mielodisplástico, la administración de G-CSF y Epo  no produjo mejoría de los niveles de hemoglobina ni  redujo la necesidad de transfusiones.

El presente trabajo tiene como objetivo el estudio del efecto  sobre la granulopoyesis del tratamiento con   factor estimulante de colonias recombinante humano (G-CSF) administrado en forma individual, comparado con su administración   en forma conjunta con   eritropoyetina recombinante humana (Epo)  . Todos los estudios se realizan en ratones pretratados con ciclofosfamida, droga que deprime tanto  la granulopoyesis (5) como la eritropoyesis (6).  Evaluamos la granulopoyesis mediante la medición del número absoluto de neutrófilos circulantes, y el contenido del compartimento de precursores granulopoyéticos  en médula ósea femoral y bazo 

 

 

MATERIAL Y METODOS 

Animales: se usaron ratones hembras CF1 de 3 meses de edad con 25 a 30 g de peso corporal.

Ciclofosfamida: (Cy)  (Endoxan-Asta, Labinca) La droga fue   administrada en dosis de 100mg/Kg disuelta en agua destilada apirógena, vía ip, el   día   0  de  1 ciclo  de estudio de 20 días

Factor    estimulante   de colonias de granulocitos  recombinante humano:  G-CSF: ( filgrastim). Laboratorios  Roche: 5 viales conteniendo cada uno: 30 millones de unidades =  300 mg de G-CSF. Antes de las inyecciones, la solución que contiene el G-CSF fue  diluida con buffer salino de fosfato, pH 7.4, (PBS) conteniendo 0,1 % de albúmina bovina sérica. Los animales fueron  inyectados con 20 mg/kg/día de G-CSF  vía sc, en un volumen de 100 ml/ratón, iniciándose la administración un día después de la administración de ciclofosfamida. Los animales control recibieron una dosis equivalente de solución diluyente. Se ha elegido la dosis de 20 ug/kg/día de G-CSF debido a que sí bien en pacientes neutropénicos por quimioterapia  es usado con frecuencia en dosis de 2 a 10 ug/kg/día,  al ser esta una molécula heteróloga para el ratón, (ya que existe solo una homología   parcial entre el G-CSF humano y murino), estimamos necesaria la administración de una dosis mayor a la empleada en seres humanos. 

Eritropoyetina recombinante humana: (Epo) Hemax. Laboratorios Sidus: cada frasco ampolla con liofilizado de HEMAX contiene 2000 UI  de eritropoyetina humana recombinante. Excipientes: manitol 40 mg, cloruro de sodio 7 mg, fosfato monosódico 2,8 mg, fosfato disódico dodecahidratado 8 mg, albúmina humana 5 mg, disueltos  en 2 ml de agua bidestilada estéril apirógena. Los lotes de animales que recibían diariamente una inyección de 20 ug/kg/ de G-CSF fueron  inyectados simultáneamente con 50 U de Epo/kg,   los días 1,   4, 7, 10, 13, 16 y 19. Lotes de seis animales fueron sacrificados los días 0,  4, 8, 12, 16 y  20. 

Contajes celulares: los leucocitos periféricos/mm3 se contaron en hemocitómetro de Neubauer, mediante extracción de 300µl de sangre por punción cardíaca. Las células de médula ósea femoral y de bazo fueron procesadas con homogenador de vidrio y contadas en hemocitómetro standard.

Morfología celular: fue evaluada en sangre periférica, médula ósea y bazo mediante frotis teñidos con May Grünwald-Giemsa.

Análisis estadístico: los datos se analizaron mediante ANOVA y el Test de comparaciones múltiples de  Student-Neuman-Keuls. Los datos son expresados como promedio ± un error estándar y se consideró significativa una p<  .05.  

 

RESULTADOS

En los lotes de animales control  que solo recibieron ciclofosfamida  el número de  neutrófilos periféricos/ mm3 disminuyó el día 4 y  luego se observó  un aumento , aunque no significativo hasta el día 16 del experimento, retornando la cifra de polimorfonucleares al valor normal a los 20 días posteriores a la administración del quimiterápico.  No se observó diferencia significativa del número de neutrófilos circulantes  en los animales que recibieron en forma conjunta la administración de Epo y G-CSF, con respecto al lote control.  La administración diaria de 20 ug/kg/día de G-CSF desde del día 1 hasta el día 20 del experimento , por otro lado, a  diferencia de lo que sucede en murinos normales (7),    no fue capaz de sostener un número significativamente incrementado de neutrófilos mientras duró su aplicación y solo produjo un incremento significativo de su  número  el día 8.   Aún así, es de hacer notar que el número de neutrófilos estuvo aumentado  también los días 12 a 20, comparados tanto con el lote control como con el lote que recibió simultáneamente Epo y G-CSF, aunque no en forma significativa. (Fig. Nº1).

                 

 

Fig 1: Cambios  en  el número absoluto de neutrófilos circulantes. Todos los ratones fueron inyectados con ciclofosfamida en dosis de 100 mg/kg   el día 0 del experimento. .Epo y G-CSF fueron administrados en forma conjunta  según el siguiente esquema  y dosis: Epo: 30 U/ kg  los días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19 y G-CSF 20 ug/kg /día desde el día 1 hasta el día 20, (barras negras). G-CSF fue administrado  en dosis de 20ug/kg/día  desde el día 1 a 20, (barras punteadas). Los animales control (barras blancas ) recibieron  PBS. Las barra representan el valor promedio ± 1  Error Standard. (***) indica  diferencia significativa entre lote Cy + G-CSF   y lote Cy-control p< .001.

 

El estudio de la población granulocítica femoral no mostró variaciones significativas a lo largo del experimento en los animales control a los que se administró únicamente  ciclofosfamida, ni en los que fueron tratados en forma   conjunta con Epo y G-CSF. Sin embargo, en los animales que fueron inyectados con  G-CSF, hubo un aumento significativo de la población granulocítica femoral    los días 16 y 20 del experimento, comparado tanto con el lote control  como con el lote de animales que recibieron la administración conjunta de Epo y G-CSF. (Fig. Nº 2)

 

 

 

 

 

Fig 2: Cambios  en  el número de células precursoras granulocíticas femorales. Animales inyectados con ciclofosfamida en dosis de 100 mg/kg   el día 0 del experimento recibieron inyecciones simultáneas  de  .Epo y G-CSF según el siguiente esquema  : Epo: 30 U/ kg  los días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19 y G-CSF 20 ug/kg /día desde el día 1 hasta el día 20  (barras negras) ó fueron tratados solo con  G-CSF en dosis de 20ug/kg/día  desde el día 1 a 20 (barras punteadas).Los lotes de animales control (barras blancas ) recibieron  PBS. Las barras representan el valor promedio ± 1  Error Standard. (***) indica  diferencia significativa entre lote Cy +G-CSF y lote Cy-control p< .001; (**): p< .01. ( b )  indica diferencia significativa entre los lotes Cy + G-CSF con respecto a Cy+ Epo +G-CSF p< .01; ( c ): p< .05.

 

 

En el bazo, la administración de ciclofosfamida  disminuyó la población de células precursoras granulocíticas el día 4, retornando  luego el valor de las mismas a niveles normales.  En los animales que fueron inyectados simultáneamente con Epo y G-CSF  se observó un importante aumento de células granulocíticas  el día 12 del experimento, no existiendo diferencias significativas con el lote control en el resto de días  en que se sacrificaron los animales. En los animales que recibieron inyecciones  de G-CSF   no se observaron cambios significativos de células precursoas granulocíticas esplénicas, comparado con el lote control tratado con ciclofosfamida , salvo en el día 8 del experimento en que se observó un aumento de su contenido.  A los 12 días, el número absoluto  de precursores granulocíticos esplénicos en los animales tratados con G-CSF fue significativamente inferior , comparado con los animales tratados simultáneamente con Epo y G-CSF. 

 

 

Fig 3: Cambios  en  el compartimento de células precursoras granulocíticas esplénicas en animales pretratados con ciclofosfamida en dosis de 100 mg/kg   el día 0 del experimento . Los valores de ratones que recibieron inyecciones simultáneas  de  .Epo y G-CSF según el siguiente esquema  : Epo: 30 U/ kg  los días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19 y  20 ug/kg /día  de G-CSF desde el día 1 hasta el día 20  se representan  con barras negras. Los valores de ratones  tratados  con  G-CSF en dosis de 20ug/kg/día  desde el día 1 a 20 se representan por barras punteadas. Los valores de animales control que recibieron PBS se representan por barras blancas.. Las barras representan el valor promedio ± 1  Error Standard. (***) indica  diferencia significativa entre lote Cy +G-CSF y lote Cy-control p< .001; (*): p< .05. ( a )  indica diferencia significativa entre los lotes Cy + G-CSF con respecto a Cy+ Epo +G-CSF p< .001. 

 

DISCUSION

La  administración de ciclofosfamida, quimioterápico de amplio uso  en tratamiento de neoplasias de diverso origen tiene, entre otros,  un efecto adverso depresor tanto de la línea celular  granulopoyética como de la eritropoyética (8).   En el presente trabajo hemos empleado un animal pretratado con ciclofosfamida para estimular en forma simultánea ambas líneas celulares administrando eritropoyetina y factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante humanos   a los efectos de evaluar el efecto producido por ambos  factores de crecimiento hematopoyéticos  sobre la granulopoyesis   y  compararlos  con los  cambios producidos por la administración   de factor estimulante de colonias de granulocitos usado individualmente.  La administración de ciclofosfamida, en la dosis empleada deprimió muy transitoriamente la granulopoyesis y luego produjo    por si misma un aumento en el número de polimorfonuclares periféricos  que persiste hasta el día 20, (probablemente como efecto compensatorio).   La administración de G-CSF en forma individual a los animales pretratados con ciclofosfamida produjo un aumento del número de neutrófilos periféricos  superior  al obtenido cuando se administró este factor estimulante de la granulopoyesis en forma conjunta con eritropoyetina,  a partir del día 8 y hasta el final del experimento a los 20 días, ,  aunque el aumento solo fue significativo el día 8. Este resultado sugiere que Epo y G-CSF podrían estar compitiendo por la célula progenitora común de las líneas granulopoyética y eritropoyética: la unidad formadora de colonias de granulocitos, eritrocitos, megacariocitos y macrófagos  (GEMM-CFU), motivo por el cual el efecto estimulante granulopoyético de G-CSF no se hace presente cuando este se administra en forma simultánea con Epo . A nivel medular femoral  , la ciclofosfamida  administrada en el día 0 del experimento deprimió significativamente  los valores de células granulocíticas en  el día 4, retornando luego dichos valores a cifras que no difirieron estadísticamente de los hallados en animales normales. La administración  de G-CSF en forma individual  a los animales pretratados con ciclofosfamida aumentó significativamente el contenido de células granulocíticas  entre los días 16 y 20, comparado tanto con el lote de animales a los que se administró en forma conjunta Epo y G-CSF  como con los animales control que recibieron ciclofosfamida sola. El hecho de que cuando se administró  G-CSF en forma conjunta con Epo no se produjo estímulo de la granulopoyesis femoral en ninguno de los lotes estudiados también sugeriría un efecto competitivo de ambos factores de crecimiento sobre una célula progenitora común. Los importantes pero transitorios  cambios de la granulopoyesis a nivel esplénico, sin embargo,  pueden ser explicados por efectos de migración   de progenitores desde médula ósea  a bazo y probablemente  de bazo a médula ósea, ya observados en trabajos previos  (5,9).

Los resultados obtenidos permiten sugerir que podría haber un efecto competitivo entre factores de crecimiento específicos de las líneas granulocítica y eritrocítica  sobre su célula antecesora común: la GEMM-CFU,  en el modelo experimental  usado, aunque es necesario agregar el estudio de células progenitoras mas tempranas para aportar datos   que contribuyan a corroboren esta hipótesis.

 

 

BIBLIOGRAFÍA

 

1.       Kolesar JM. Novel approaches to anemia associated with cancer and chemotherapy. Am J Health Syst Pharm. 2002 ; 59: S8-11.

2.       Alexopoulus A. Kouroussis C, Malamos N, Kakolyris S, Kalbakis K, Kosmas C, Mavroudis D, Agelaki S, Vlachonicolis J, Sarra E, Rigatos G, Georgoulias V. Docetaxel in combination with mitoxantrone and granulocyte colony-stimulating factor as front-line chemotherapy in metastatic breast cancer: a multicenter phase II study.Ann Oncol 2001; 12: 793-798.

3.       Negrin RS, Stein R, Doherty K, et al. Maintenance treatment of the anemia  of myelodisplastic syndromes with recombinant human granulocyte colony stimulating factor  and erythropoietin: evidence for in vivo synergy. Blood  1996; 87: 4076 – 4081. 

4.       Musto P, Falcone A, Carotenuto M. Granulocyte colony stimulating factor and erythropoietin for the anemia of myelodisplastic syndromes: a real improvement with respect to erythropoietin alone?. Blood  1994; 84: 1687 – 1688.

5.       L. Barrios, O. H. Poletti and M. I. Agustini . The influence of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on granulopoiesis in mice recovering from cyclophosphamide treatment. Methods Find Exp Clinic Pharmacol  2000; 22: 275 – 280. 

6.       Tas F, Eralp Y, Basaran M,  et al. Anemia in Oncology Practice Relation to Diseases and Their Therapies. American Journal of Clinical Oncology 2002;25:371-379

7.       Barrios L, Agustini MI, Poletti OH, Juaristi J, Brandan NC. Effects of recombinant human granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) on murine bone marrow and spleen erythropoiesis.  APPTLA  1998; 48: 18 – 24.

8.       Dong M. Shin DM,  Glisson BS.  Khuri  FR et al. Phase II study of induction chemotherapy with paclitaxel, ifosfamide, and carboplatin (TIC) for patients with locally advanced squamous cell carcinoma of the head and neck. Cancer 2002; 95: 322-330

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